膠原探索
Ⅱ型膠原蛋白對人軟骨細胞生物學(xué)特性的影響
蔣萍，蔚芃，趙明才，陳瓊，王梓(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，四川省南充市637000)蔣萍，女，1983年生，四川省南充市人，漢族，2012年川北醫(yī)學(xué)院畢業(yè)，碩士，醫(yī)師，主要從事骨與關(guān)節(jié)損傷修復(fù)研究。?通訊作者：蔚芃，主任醫(yī)師，川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，四川省南充市637000?文章亮點：1.膠原蛋白作為天然高分子生物材料已被證實可作為軟骨組織工程支架材料，并且它作為底物能刺激軟骨細胞生長，可用于體外軟骨細胞培養(yǎng)，但關(guān)于不同類型膠原蛋白刺激成軟骨作用的能力仍存在爭議。2.實驗創(chuàng)新性使用Ⅰ、Ⅱ型膠原包被培養(yǎng)板和普通培養(yǎng)板同時培養(yǎng)人軟骨細胞，研究Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對人軟骨細胞生物學(xué)特性的影響。發(fā)現(xiàn)膠原蛋白包被培養(yǎng)板培養(yǎng)軟骨細胞優(yōu)于普通培養(yǎng)板，其中Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板在培養(yǎng)軟骨細胞時更能維持細胞形態(tài)，延長去分化現(xiàn)象出現(xiàn)的時間，更利于細胞再分化。關(guān)鍵詞：生物材料；軟骨生物材料；Ⅰ型膠原蛋白培養(yǎng)板；Ⅱ型膠原蛋白培養(yǎng)板；人軟骨細胞；體外培養(yǎng)主題詞：膠原Ⅰ型；膠原Ⅱ型；軟骨細胞基金資助：四川省衛(wèi)生廳項目?摘要背景：實驗證明膠原蛋白底物具有刺激成軟骨的作用，但關(guān)于不同類型膠原蛋白刺激成軟骨作用的能力仍存在爭議。目的：觀察Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對體外培養(yǎng)人軟骨細胞生物學(xué)特性的影響。方法：將P3代人軟骨細胞分別加入普通培養(yǎng)板、Ⅰ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板、Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)10d內(nèi)，MTT法繪制細胞生長曲線；培養(yǎng)28d后，采用ELISA法、聚合酶鏈反應(yīng)、二甲基亞甲基藍比色等方法檢測3種培養(yǎng)板中軟骨細胞分泌Ⅰ膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白及糖胺多糖的量。?結(jié)果與結(jié)論：Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板中軟骨細胞數(shù)量最多，增殖速度為Ⅰ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板的2倍、普通培養(yǎng)板的5倍。Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板中軟骨細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白最少，與普通培養(yǎng)板板檢測結(jié)果差異有顯著性意義(P<0.01)，與Ⅰ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板檢測結(jié)果差異無顯著性意義；Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板中軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原蛋白、糖胺多糖最多，與其他兩種培養(yǎng)板檢測結(jié)果差異有顯著性意義（P<0.01）。表明膠原蛋白包被培養(yǎng)板培養(yǎng)軟骨細胞優(yōu)于普通培養(yǎng)板，其中Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板在培養(yǎng)軟骨細胞時更能維持細胞形態(tài)，延長去分化現(xiàn)象出現(xiàn)的時間，更利于細胞再分化。蔣萍，蔚芃，趙明才，陳瓊，王梓.Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對人軟骨細胞生物學(xué)特性的影響[J].中國組織工程研究，2014，18(30):4845-4850.?EffectoftypeIortypeIIcollagenonbiologicalcharacteristicsofhumanchondrocytes?JiangPing,Master,Physician,DepartmentofOrthopedics,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,SichuanProvince,ChinaCorrespondingauthor:WeiPeng,Chiefphysician,DepartmentofOrthopedics,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,SichuanProvince,ChinaAccepted:2014-05-21?JiangPing,WeiPeng,ZhaoMing-cai,ChenQiong,WangZi(DepartmentofOrthopedics,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,SichuanProvince,China)?AbstractBACKGROUND:Experimentshaveshownthatthecollagensubstratehasthecapabilityofstimulatingcartilagegeneration,butthestimulatingroleofdifferenttypesofcollagensubstratesremainscontroversial.OBJECTIVE:ToinvestigatetheeffectoftypeIandtypeIIcollagenonthebiologicalcharacteristicsofhumanchondrocytesculturedinvitro.METHODS:Humanchondrocytesatpassagewereculturedontotheordinarycultureplates(ordinaryplate),typeIcollagen-coatedcultureplates(typeIplate),andtypeIIcollagen-coatedcultureplates(typeIIplate).CellgrowthcurvesweredeterminedbyMTTmethodaftercellswereculturedfor10days.ByELISA,PCR,and1,9-dimethylmethylenebluetechnology,typeIandtypeIIcollagenandglycosaminoglycancontentswerequantitativelydetectedincartilagecells28daysafterculture.RESULTSANDCONCLUSION:ThenumberofcartilagecellswasthehighestintypeIIplate,whichwastwiceofthatintypeIplateandfivetimesofthatinordinaryplate.CartilagecellsintypeIIplatesecretedtheleastamountoftypeIcollagen,whichshowedsignificantdifferencescomparedwiththeordinaryplate(P<0.01)andhadnostatisticallysignificantdifferencewithtypeIplate(P>0.01).CartilagecellsintypeIIplatesecretedthemostamountoftypeIIcollagenandglycosaminoglycan,showingsignificantdifferencescomparedwiththeothertwoplates(P<0.01).Thecartilagecellsculturedincollagenplatesarebetterthanthatculturedinordinarycultureplate,typeIIcollagencultureplateisbetterthantypeIcollagencultureplateinmaintainingcellshape,extendingthededifferentiationpattern,andpromotingcelldifferentiation.Subjectheadings:collagentypeI;collagentypeII;chondrocytesFunding:agrantbySichuanProvincialHealthMinistry?JiangP,WeiP,ZhaoMC,ChenQ,WangZ.EffectoftypeIortypeIIcollagenonbiologicalcharacteristicsofhumanchondrocytes.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2014;18(30):4845-4850.引言隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，軟骨組織工程學(xué)為人們提供了更為理想的修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損方法。如何獲得大規(guī)模具有增殖活性的種子細胞為當(dāng)前面臨的最大限制因素之一。1994年Brittberg[1]體外培養(yǎng)患者健康軟骨細胞，獲得大量純化軟骨細胞，再移植到其關(guān)節(jié)軟骨缺損部位治療關(guān)節(jié)軟骨缺損，開創(chuàng)了應(yīng)用自體軟骨細胞移植治療軟骨損傷的新技術(shù)。該技術(shù)在1997年得到美國FDA正式批準后已在歐洲國家廣泛使用，獲得大量純化且具有再生活力的軟骨細胞是該技術(shù)的關(guān)鍵，但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)軟骨細胞體外培養(yǎng)傳代會發(fā)生去分化現(xiàn)象，喪失成軟骨能力。為了解決體外培養(yǎng)軟骨細胞的去分化現(xiàn)象，越來越多的研究被報道，早在1975年就有實驗證明膠原蛋白底物具有刺激成軟骨的作用[2]。膠原也稱膠原蛋白，是脊椎動物體內(nèi)的一種結(jié)構(gòu)蛋白，人體內(nèi)含量非常豐富，占動物體膠原纖維固體物的80%-90%，占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%-30%，也是細胞外基質(zhì)的主要成分[3]。由于膠原蛋白是天然的生物資源，來源廣泛且具有獨特的生物相容性、可降解性、低免疫原性，還有如高拉伸強度、止血性能及促進細胞生長等獨特的性能，被越來越重視。由于膠原蛋白具有止血、促進組織再生和功能恢復(fù)的作用，被制成海綿、絲線、薄膜等醫(yī)療器械用于普外科、口腔、血管外科等多個科室，同時也因其組織相容性、可降解性被作為皮膚移植材料用于燒傷、創(chuàng)傷的修補。19世紀80年代，Zyderm膠原植入物被作為一種注射型膠原蛋白制劑在臨床上開始使用，在治療面部軟組織變形方面已使用近30年[4]。人們成功將膠原蛋白制成各種各樣的組織工程支架，如皮膚、骨組織、氣管和血管支架，Award等[5]混合自體同源間葉細胞的莖狀細胞和膠原蛋白凝膠制作肌腱用于腱后修復(fù)。Wakitani等[6]用嵌入軟骨細胞的膠原蛋白凝膠修復(fù)軟骨缺陷。膠原蛋白作為天然高分子生物材料已被證實可作為軟骨組織工程支架材料，并且它作為底物能刺激軟骨細胞生長，可用于體外軟骨細胞培養(yǎng)，但關(guān)于不同類型膠原蛋白刺激成軟骨作用的能力仍存在爭議。本實驗使用Ⅰ、Ⅱ型膠原包被培養(yǎng)板和普通培養(yǎng)板同時培養(yǎng)人軟骨細胞，研究Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對人軟骨細胞生物學(xué)特性的影響。?材料和方法設(shè)計：前瞻性實驗。時間及地點：于2008年1月至2009年4月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫研究所完成。材料：收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科因股骨頸骨折行?全髖置換20例患者的股骨頭標(biāo)本，患者年齡56-84歲，平均66歲。供者對實驗均知情同意并簽署知情同意書。?實驗方法：軟骨細胞的分離及培養(yǎng)：將收集的關(guān)節(jié)軟骨以體積分數(shù)75%乙醇消毒后，用手術(shù)刀片刮除關(guān)節(jié)表面軟組織及可能覆蓋在其上的滑膜，再將關(guān)節(jié)表面軟骨薄層組織削下來，使削下的軟骨組織盡量薄，不能削到軟骨下骨。將收集的軟骨組織片放入裝有含青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100U/mL)的PBS中漂洗3次，洗去軟骨表面血液及可能存在的滑膜，然后移入小玻璃瓶里，剪成1.0-2.0mm3，在含雙抗的PBS清洗后轉(zhuǎn)入50mL離心管內(nèi)，加入0.2%Ⅱ型膠原酶2mL消化。將消化后的軟骨組織和液體通過200目金屬篩網(wǎng)，將未消化的軟骨組織殘渣放入50mL離心管中，加入Ⅱ型膠原酶及DMEM繼續(xù)消化，根據(jù)消化程度決定消化時間，但消化時間最長不超過12h為宜。過濾得到的液體放入15mL離心管中，1000r/min離心7min，去上清，加DMEM吹打，盡量輕柔，再次1000r/min離心7min后棄去上清，反復(fù)清洗3次洗去Ⅱ型膠原酶。將錐蟲藍檢測活力大于95%的原代軟骨細胞以4×108L-1濃度接種于25cm2塑料培養(yǎng)培養(yǎng)瓶。待軟骨細胞長滿培養(yǎng)瓶85%以上，棄原培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加2.0-3.0mL含EDTA的0.25%胰酶(以剛好覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜)消化2min，鏡下觀察貼壁細胞變圓脫落，待細胞大部分脫落后，加入含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。將消化下的細胞懸液用培養(yǎng)液混勻后移入15mL離心管，1000r/min離心7min，棄上清，加含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，計數(shù)細胞，按1∶2接種于兩個25cm2培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，記
2019-07-23
骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中Ⅰ，Ⅱ型膠原蛋白表達與其力學(xué)性能
Correlations between type Ⅰ and Ⅱ collagen expressions and mechanical strength in osteoporotic fracture healing.Yuan Shao-hui, Liu Wei, Wu Bin-qi, Han Xi-guang, Bo Chao-gang
2019-07-22
雞胸軟骨Ⅱ型膠原對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用
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2019-07-21
